El desarrollo de nuevas pruebas de coronavirus que podrían ayudar a poner fin a la pandemia

Los investigadores están luchando para encontrar otras formas de diagnosticar el coronavirus y realizar millones de pruebas por semana, un paso clave para volver a la normalidad.

El momento no podría haber sido peor. En marzo, justo cuando el brote de coronavirus de Tailandia comenzó a aumentar, tres hospitales en Bangkok anunciaron que habían suspendido las pruebas para detectar el virus porque se habían quedado sin reactivos. Los investigadores tailandeses se apresuraron a ayudar a los laboratorios clínicos del país a satisfacer la demanda. En busca de pruebas asequibles y fáciles de usar, el biólogo de sistemas Chayasith (Tao) Uttamapinant en el Instituto de Ciencia y Tecnología Vidyasirimedhi en Rayong contactó a un viejo conocido: el co-descubridor de CRISPR, Feng Zhang, quien había estado desarrollando un ensayo para coronavirus inspirado en la tecnología de edición de genes.

En cuestión de días, Uttamapinant recibió kits del laboratorio de Zhang en el MIT y Harvard en Cambridge, Massachusetts, y los probó en muestras de un hospital en Bangkok. «Los kits son bastante baratos y funcionan bien», dice Uttamapinant, quien espera que la prueba sea aprobada para uso clínico para fin de año. Se ha asociado con bioquímicos en Tailandia para producir los reactivos de prueba localmente, con Zhang en espera de apoyo. «Este esfuerzo para producir todo localmente tendrá un impacto duradero en el monitoreo y diagnóstico de enfermedades infecciosas en esta parte del mundo», dice Uttamapinant.

Los epidemiólogos dicen que las pruebas masivas para el SARS-CoV-2, que requieren millones de pruebas por país por semana, son la forma más práctica de salir de la crisis actual. Permite a los funcionarios aislar a aquellos que dan positivo, limitar la propagación de la enfermedad y ayudar a determinar cuándo es seguro relajar las restricciones.

Pero los países están luchando para aumentar las pruebas. Una razón es que la prueba estándar para detectar SARS-CoV-2, basada en una técnica de laboratorio llamada reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa o RT-PCR, requiere personal capacitado, suministros químicos específicos e instrumentos costosos que demoran horas en proporcionar resultados y, a menudo, están disponibles solo en laboratorios que brindan servicios de rutina. Esto limita el número de pruebas que se pueden hacer, especialmente en los países en desarrollo. Incluso en regiones ricas como los Estados Unidos, los proveedores han reportado una grave escasez de kits de prueba y materiales requeridos, desde hisopos nasales hasta reactivos químicos, debido a problemas en la cadena de suministro. Ampliar rápidamente las pruebas confiables también ha resultado ser un desafío: las primeras pruebas de RT-PCR desarrolladas por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos funcionaron mal, por ejemplo, lo que provocó una serie de retrasos.

Grupos de investigación en todo el mundo ahora están ideando pruebas que van más allá del PCR.
Se están desarrollando docenas de métodos de diagnóstico, todos los cuales detectan material viral pero de diferentes maneras: algunos son ajustes para RT-PCR que hacen que la prueba sea más rápida o fácil de usar; otros usan la herramienta de edición de genes CRISPR para concentrarse en fragmentos genéticos de SARS-CoV-2; y algunos identifican el virus usando proteínas que se encuentran en su superficie. Muchas de estas pruebas, como las de Zhang, se están validando con muestras clínicas, y algunas ya están en la clínica.

En abril, los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. destinaron 1.500 millones de dólares para el desarrollo de pruebas de coronavirus, con el objetivo de permitir millones de pruebas por semana para fines de este verano. «Cuanto antes podamos encontrar una solución», dice Zhang, «antes podremos reanudar alguna forma de normalidad».

Si esas pruebas están listas pronto, serían buenas noticias para la pandemia actual y para brotes futuros. Muchos de los ensayos en desarrollo podrían adaptarse fácilmente a un patógeno emergente una vez que se decodifique su secuencia genética, dice Isabella Eckerle, viróloga de la Universidad de Ginebra en Suiza. Eckerle dice que, aunque la prueba ideal aún no existe, «hay muchas cosas en en el pipeline que podrían ser útiles».

Más allá del PCR

Las pruebas para el coronavirus se dividen en dos grandes categorías:
1) las que detectan material genético del virus o las moléculas en su superficie, que se utilizan para diagnosticar si una persona tiene una infección activa, y 2) las que detectan la presencia de anticuerpos, revelando si alguien ha sido infectado y ha desarrollado una respuesta inmune al virus. Las pruebas de anticuerpos tienen un uso diagnóstico limitado: si a una persona se le realiza la prueba temprano en el curso de la infección, cuando su respuesta inmune aún se está acumulando, la prueba podría no detectar anticuerpos.

Y debido a que las personas con el coronavirus son más infecciosas al inicio de los síntomas, las pruebas de material viral son cruciales para identificar quién debe estar aislado. En los Estados Unidos, los ensayos de diagnóstico viral representan la mayoría de las pruebas realizadas.

La prueba de diagnóstico “estándar de oro”, que utiliza RT-PCR, funciona buscando en una muestra tomada de células o líquido en la nariz o la garganta de una persona una secuencia genética específica del SARS-CoV-2. Si se encuentra la secuencia viral, la técnica la amplifica a niveles que se pueden detectar. Primero, el virus ARN se convierte en ADN. Luego, las secuencias de ADN de diseño corto conocidas como cebadores realizan varios trabajos. Algunas etiquetan secciones específicas del código genético viral para ayudar a duplicar la secuencia millones de veces, usando un proceso que requiere calentamiento y enfriamiento repetidos. Esta amplificación hace que sea fácil detectar incluso cantidades minúsculas de virus, hasta una sola molécula de ARN por microlitro. Otros cebadores agregan etiquetas a las cadenas de ADN amplificadas. Estas etiquetas liberan una señal fluorescente que es medida por una computadora, señalando la presencia del virus. Las pruebas de RT-PCR estándar para el coronavirus tardan entre una y cuatro horas y pueden tener una precisión de hasta el 100%, aunque la precisión de cualquier prueba de diagnóstico depende de muchos factores, como cuándo se tomó una muestra en el curso de la infección.

Varios enfoques tienen como objetivo reducir el tiempo necesario para obtener un resultado de prueba, como amplificar el ADN a una temperatura constante, lo que elimina la necesidad de múltiples rondas de calentamiento y enfriamiento. Algunos de estos son ensayos existentes que se están personalizando para detectar SARS-CoV-2. Por ejemplo, las compañías estadounidenses de atención médica Cepheid y Abbott han desarrollado ensayos de coronavirus que se ejecutan en plataformas de hardware del tamaño de una tostadora y tardan menos de una hora en realizarse. Sin embargo, los reactivos y las plataformas pueden ser costosos, y Abbott ha advertido que el uso de una solución particular para diluir las muestras de los pacientes puede evitar que su dispositivo detecte el virus.

Varias otras pruebas se basan en una técnica llamada amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), que también funciona a una temperatura constante y se ha utilizado para identificar virus como el Zika. LAMP se basa en dos enzimas, una para convertir el ARN viral en ADN y otra para copiar el ADN, así como un conjunto de cuatro a seis cebadores cortos diseñados para reconocer diferentes fragmentos del genoma viral. Estos fragmentos no solo ayudan a comenzar la copia, como en RT-PCR, sino que también permiten que las cadenas de ADN recién copiadas formen estructuras en bucle que pueden amplificarse mucho más rápidamente que en la PCR estándar. Sin embargo, es menos preciso y solo se pueden ejecutar unas pocas docenas de muestras a la vez.
Debido a que la técnica no necesita instrumentos especiales, puede usarse en el campo y en regiones que carecen de equipos avanzados, incluidas áreas remotas y campos de refugiados, dice Vicent Pelechano, un experto en genómica del Instituto Karolinska en Estocolmo, quien desarrolló conjuntamente un ensayo basado en LAMP para SARS-CoV-2. «Todo lo que necesitas es un tubo de ensayo que contenga los cebadores, una pipeta, una placa calefactora y una olla de agua», dice. Una sola prueba costaría alrededor de $ 1, sin contar la mano de obra.

En el laboratorio, la prueba basada en LAMP de Pelechano y sus colegas pudo detectar tan solo 10 copias de un genoma de SARS-CoV-2 en no más de 40 minutos. Luego, los investigadores probaron el ensayo utilizando muestras de 248 personas con infección confirmada por coronavirus, y pudieron detectar el virus casi el 90% del tiempo. Pelechano reconoce que la prueba podría resultar menos precisa para algunas muestras, como las contaminadas con sangre.

Pero en algunos lugares, la compensación en precisión podría valer la pena. Los países de bajos ingresos y las zonas devastadas por la guerra no tienen suficientes máquinas de PCR para realizar la prueba de diagnóstico estándar para el coronavirus, dice Nabil Karah, un microbiólogo clínico de la Universidad de Umeå en Suecia. Karah está trabajando con otros científicos y con el equipo de Pelechano para llevar su prueba basada en LAMP a Siria para aumentar la capacidad de prueba local.

Ensayos de aceleración

A principios de marzo, mientras los diagnósticos luchaban por mantenerse al día con la propagación del coronavirus en los Estados Unidos, el ingeniero químico Howard Salis se sintió obligado a ayudar. Para acelerar las pruebas, decidió probar un poderoso enfoque de secuenciación que había revolucionado el ritmo de la investigación genómica. Aproximadamente tres semanas después, el equipo de biólogos sintéticos de Salis en la Universidad Estatal de Pensilvania en University Park encontró una manera de analizar muestras de casi 20,000 personas en una sola corrida.

Su método agrega «códigos de barras moleculares» individuales a las muestras clínicas antes de agruparlas y usar la secuenciación de próxima generación para decodificarlas todas a la vez. Los códigos de barras permiten a los investigadores identificar qué muestras dieron positivo. Otros equipos han publicado detalles de enfoques similares de pruebas en masa, incluida la empresa de nueva creación de biotecnología Octant en Emeryville, California, e investigadores del Broad Institute.

Debido a que los secuenciadores de ADN pueden leer cientos de millones de fragmentos de ADN a la vez, los investigadores estiman que las pruebas basadas en secuenciación podrían usarse para analizar hasta 100,000 muestras en una sola ejecución. Por el contrario, una máquina de PCR estándar puede analizar solo docenas o cientos de muestras al mismo tiempo. Pero estas pruebas de secuenciación toman tiempo, al menos 12 horas, y requieren equipos especializados en instalaciones centralizadas. Obtener millones de muestras entregadas en esas instalaciones no es trivial.

Otra forma en que los investigadores intentan llevar las pruebas a las masas es idear ensayos que puedan usarse en instalaciones de pruebas temporales, centros de pruebas de manejo e incluso en los hogares de las personas.

Al menos dos equipos están aprovechando la tecnología de edición de genes CRISPR para impulsar tales pruebas. Por ejemplo, los investigadores liderados por Zhang han desarrollado un ensayo de coronavirus que se puede ejecutar en un solo tubo de ensayo en aproximadamente una hora. Pero aún requiere calentar la muestra a aproximadamente 65°C, y no es tan sensible como un ensayo basado en PCR. «Está bien, porque es mucho más fácil de usar», dice Zhang. Cuando se probó varias veces en muestras de 12 personas infectadas con coronavirus, el ensayo detectó el virus en casi todas las ocasiones.

La prueba se basa en un enfoque que Zhang co-desarrolló en 2017, llamado SHERLOCK, que se basa en la capacidad de la maquinaria CRISPR para concentrarse en secuencias genéticas específicas. Los investigadores programan una molécula guía para engancharse a un tramo particular del genoma del SARS-CoV-2. Si la molécula guía encuentra una coincidencia, una enzima CRISPR genera una señal que puede detectarse como un brillo fluorescente o como una banda oscura en una varilla de medición de papel. El 6 de mayo, la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) autorizó un ensayo de coronavirus SHERLOCK para uso de emergencia. La prueba es realizada por la firma de biotecnología Sherlock BioSciences en Cambridge, Massachusetts (de la cual Zhang es cofundador), y la compañía se ha asociado con un fabricante para producir en masa los kits.

Mammoth Biosciences, una compañía de diagnóstico cofundada por la pionera CRISPR Jennifer Doudna de la Universidad de California, Berkeley, también está buscando una autorización de uso de emergencia para su prueba de coronavirus basada en CRISPR, dice la directora de tecnología y cofundadora de Mammoth, Janice Chen. La prueba se basa en un resultado anterior que muestra que la tecnología puede detectar el virus del papiloma humano. La compañía, con sede en San Francisco, California, ahora está tratando de hacer que la prueba sea lo suficientemente simple y barata para que cualquiera pueda usarla en su hogar, dice Chen. «El objetivo final es llevar los diagnósticos directamente a los consumidores: el PCR no ha podido llegar allí», dice.

Guozhen Liu, un bioingeniero de la Universidad de Nueva Gales del Sur en Sydney, Australia, dice que tecnologías como CRISPR podrían ser «un cambio reglas de juego» en la pandemia actual. Gracias a su capacidad para identificar fragmentos genéticos de forma rápida y precisa, estos enfoques «pueden encontrar una aguja en un pajar», dice Liu. Utilizan diferentes reactivos de los ensayos basados en RT-PCR, útiles cuando hay escasez de suministros químicos para pruebas estándar, y pueden diseñarse para atacar a cualquier patógeno. Por ejemplo, un equipo dirigido por el biólogo computacional Pardis Sabeti en el Broad Institute creó ‘chips’ de goma del tamaño de un teléfono inteligente que puede buscar 1,000 muestras para un solo virus, o 5 muestras para un panel de 169 virus que se sabe que infectan humanos.

Cribado de superficie

Un enfoque diferente para pruebas de diagnóstico más rápidas y baratas sería buscar moléculas que se asientan en la superficie del virus, en lugar de tratar de detectar el genoma del virus. Dicha prueba contendría un anticuerpo diseñado para unirse a una proteína específica o antígeno, similar a la tecnología que permite las pruebas de embarazo en el hogar. Estos ensayos, que son económicos de producir y simples de realizar, ya se utilizan para detectar infecciones de influenza. Pero las pruebas de antígeno no contienen un paso de amplificación de la misma manera que las pruebas de material viral, por lo que son menos sensibles.

El 8 de mayo, la FDA otorgó su primera autorización de uso de emergencia para una prueba de antígeno de coronavirus que se dirige a la proteína nucleocápside en la superficie del virus. La FDA de Taiwán está evaluando un ensayo similar que podría proporcionar resultados en 20 minutos, dice el biólogo computacional An-Suei Yang de la Academia Sinica en Taipei, quien desarrolló la prueba. El equipo de Yang usó inteligencia artificial para identificar anticuerpos que podrían unirse a proteínas en la superficie del coronavirus. Yang dice que los investigadores aún no lo han probado en muestras de coronavirus de personas infectadas.

Incluso una vez que una prueba está funcionando maravillosamente en el laboratorio, aún enfrenta un arduo viaje hacia el uso masivo. El primer desafío es verificar el rendimiento, porque la calidad puede variar. «Es un salvaje oeste para el desarrollo de ensayos», dice Catharina Boehme, directora ejecutiva de la Foundation for Innovative New Diagnostics (FIND), un grupo sin fines de lucro en Ginebra que está colaborando con la Organización Mundial de la Salud y los Hospitales Universitarios de Ginebra y que evaluará cientos de opciones de prueba de SARS-CoV-2. La mayoría de las pruebas basadas en RT-PCR que FIND ha evaluado funcionan tan bien como el estándar de oro, mientras que las pruebas de antígeno hasta ahora han estado por debajo de las expectativas, dice Boehme.

Otro obstáculo es ampliar los ensayos para la producción en masa. Dada esta restricción, Boehme cree que no es realista que todas las nuevas pruebas se implementen antes de fin de año, aunque podría ser que un pequeño número sí. Pero una vez que estén disponibles, podrían trabajar junto con el estándar de oro para acercar a los países al objetivo de millones de pruebas por semana, y preparar al mundo para la próxima pandemia.

Incluso durante esta pantemia, dice Boehme, los investigadores no deben descuidar el desarrollo de pruebas para otros virus que causan síntomas respiratorios, y monitorear condiciones como la diabetes, que pueden empeorar las perspectivas para las personas con COVID-19. «Tenemos que ir más allá de las pruebas solo para el coronavirus», dice ella.

Ver artículo completo aquí